从试剂盒到实验室 盘点一下影响确诊人数的客观因素

新型肺炎确诊人数每天牵动着大家的情绪变化。牵挂之余，大家对于这个数字一定有着很多疑问：确诊到底需要经过哪些步骤？前期确诊速度为何那么慢？如今确诊速度为何陡然上升？

腾讯新闻疫情地图截图（截止1月30日）

其实，新型冠状病毒肺炎的确诊并不如我们想的那样简单，影响它的客观因素很多，主要有两大方面的原因：一个是试验因素的影响，另一个我概括为非试验因素。

试验因素

1.确诊，就是做PCR

PCR的原理是大量扩增微量的遗传物质。

首先，我们要明白什么是遗传物质。简单地说，遗传物质是从父母那里得到的，决定了我们的外在特征，比如我们的眼睛是大是小，脸是圆是方。而一般生物体的遗传物质分为两种，一种名字叫DNA，一种叫RNA。大多数生物体的遗传物质都是DNA，只有极少数病毒的遗传物质是RNA。DNA具有双螺旋结构，而RNA是单链结构，打个比方，DNA就好似两股拧在一起的绳子，而RNA就是一股绳子。所以DNA相比于RNA具有更加稳定，更加坚固的结构。但单股绳子使用起来更加灵活多变。所以，某些遗传物质是RNA的病毒传染性强，适应性极高，例如2003年的SARS冠状病毒和这次的新型冠状病毒。

（图片来源：veer图库）

针对这次新型冠状病毒的检测，我们最主要的方法还是检测人身上（痰液、血液、肺泡灌洗液）是否存在病毒的遗传物质，从而确诊其是否被病毒感染。但单链的RNA十分脆弱，容易断裂和降解。所以我们通过一种方法（反转录）将单链RNA先变成单链DNA，而后变成双链的DNA，让它们在检测过程中可以稳定长期的存在。

但是极其微量的遗传物质，很难被检测到。所以科研人员又想办法让极其微量的DNA成倍成倍的增加，这就是我们说的PCR过程。其实这个过程就好比，给了你砖（原材料，代指四种碱基）和石灰（粘合剂，这里代指DNA聚合酶），让你盖几栋结构一样的房子一样，只要原材料够，数量就不在话下。当数量上来以后，我们再看这个结构和砖块的排列方式（代指四种碱基的排列方式）是否和病毒的遗传物质排列顺序一样，如果一样的话，就代表病人是携带病毒的。

PCR基本原理图（图片来源：http://cache1.bioon.com.cn/）

PCR技术的设想在1983年由美国科学家凯利▪穆利斯（Kary Mullis）提出，1985年开始被应用于研究研究、医学诊断和法医鉴定等多个领域。后来很多科研人员在PCR的基础上开发了优化升级版的PCR技术，比如1996年出现的荧光PCR技术[1]。实现了遗传物质的实时定量，这就好比可以实际监测你在盖房子的时候盖了多少了。在仪器的监测下，我们可以计算从人身上取得的样本（唾液、血液和肺泡灌洗液）中的初始病毒遗传物质的含量，从而判断病人是否携带病毒。荧光PCR技术目前已经成为病毒核酸检测的一种常规方法。

新型冠状病毒核酸检测试剂盒主要就是通过荧光PCR技术，检测来自病人或疑似病人的咽拭子、血液、肺泡灌洗液等样本中的病毒遗传物质的含量，如果核酸含量超过某个临界值即为阳性结果，则认为该病人被新型冠状病毒感染；如果样本中的核酸含量低于某个临界值即阴性结果，则认为该病人未被新型冠状病毒感染[2]。

2.有了试剂盒，才能快速确诊

 新型冠状病毒核酸检测试剂盒（图片来源：今日头条）

要对新型冠状病毒进行PCR检测，我们首先还要获得新型冠状病毒遗传物质RNA的全基因组序列。简单的来讲，RNA并不是纯粹的就是一股绳子，而是有“一包”。并且RNA是由四种原材料（即四种碱基）按照特定的顺序排列，全基因组测序就是将这“一包”遗传物质的排列顺序摸清楚，这样我们“盖房子”才有参考对象，也才能知道我们盖出来的房子是不是和我们想的一样。俗话说“万事开头难”，所以在PCR复制扩增的时候，我们会人为帮助开个头，这个头儿的名字叫做“引物”（引物也是一小段遗传物质DNA，它们在粘合剂的辅助下可以帮助PCR过程迅速启动）和“荧光探针”。荧光探针与引物的作用类似，是PCR仪对遗传物质复制扩增“监控”的“摄像头”。值得注意的是，引物和荧光探针的设计与合成一定要参考遗传物质的原有序列，并不是随便什么都可以。

试剂盒就是将PCR复制扩增时候需要用到的各种原料提前配置好，之后医务人员在进行确诊的时候可以大大节省配置的时间。当然，试剂盒使用的条件（温度、时间等）也是需要开发人员去探究和摸索的，要不断的进行优化、测试和验证，以此确保试剂盒的准确性和精确性，避免出现误诊和漏诊（假阳性和假阴性）的情况，随后便可获得用于临床诊断的标准化新型冠状病毒核酸检测试剂盒。

让我们来回顾一下新型冠状病毒检测试剂盒的发展情况：

• 2020年1月7日，实验室检出一种新型冠状病毒。

• 2020年1月10日，多家研究机构联合完成了病原核酸检测，实验室人员获得病毒全基因组序列。通过对病毒基因组序列分析，是一种新型的冠状病毒。

• 2020年1月11日，国内多家上市公司获得病毒的基因序列，并各自随即启动快速检测试剂盒的研发。

• 2020年1月13日-14日，多家公司研发出核酸检测试剂盒。科华生物最早开始组织规模化的生产。

• 2020年1月16日，国家疾控中心向全国20多个地市下发快速诊断检测试剂盒。由此各地医院才真正具有了大批量同时快速检测手段。

随后，三家已经通过国家疾控中心认证的试剂盒生产企业迅速投入生产，仅捷诺生物一家公司在1月16日生产了可供7.5万人使用的试剂盒。而1月25日，已有7家企业研发的新型冠状病毒核酸检测试剂盒进入国家药监局的应急审批通道。伯杰医疗、捷诺生物和辉睿生物是国家卫健委确认的3家供应商。1月26日晚，之江生物、捷诺生物、华大基因和华大智造共四个产品已经获批。而截至1月28日又有两家企业（达安基因、圣湘生物）两个核酸病毒检测试剂盒获批。

新型冠状病毒试剂盒正式获批直供医院，使确诊时间大大缩短，最短仅需两个小时。试剂盒的快速生产为新型冠状病毒的确诊提供了必要条件，近两日，确诊病例呈指数增加也都是在意料之中。

之江生物新冠病毒检测试剂盒获批证书

非试验因素

16号就有了试剂盒，为什么到了22号之后确诊人数才开始大幅增加呢？因为还有几个非试验因素。

1.必要的流程

根据1月18日卫健委新修订的《全国各省（区、式）首例新型冠状病毒感染的肺炎病例确认程序》，对于武汉之外的其他省市，审核不仅要经过省一级，还要上报国家，并由专家小组评估，三轮都确认，才能确诊。1月23日武汉市卫健委曾表示，前期（1月16日后）对疑似病例样本检测流程是：首诊医院通过规范的预检分诊，结合临床检查、实验室检查和胸部影像检查；经专家组会诊后确认疑似病例并采样，由辖区疾控中心将样本转运到市疾控中；市疾控中心转运到省疾控中心，进行核酸检测。每天省疾控中心可检测样本200多份，从采样开始到结果返回，大约需要2-3天。26日之江生物等四个产品获批后，新型冠状病毒检测试剂盒可以直供医院，确诊时间方能大大缩减。

2.检测要素：实验室、仪器、人员

由于疑似病例较多，所以保质保量的确诊速度，需要足够多的医务人员，符合检测条件的实验室，还有足够的实验仪器。

首先说一下做荧光PCR之前，医务人员需要做哪些准备工作。一、从病人身上采样，即收集病人的咽拭子、血液和肺泡灌洗液等。由于病人具有传染性，所以在取之前，医务人员还需要时间做好防护工作；二、从样本中提取病毒的遗传物质，一次可提取大概32到96个样本，每次提取时间在0.5-2个小时之间；三、加样，就是将PCR扩增需要的模板（提取的病毒遗传物质）、原料（四种碱基）、酶（即前面说的粘合剂，DNA聚合酶）按照一定的比例加在一个试管里；四、上仪器（荧光PCR仪器），一般一个程序运行需要1.5-2个小时左右。一般一台荧光PCR仪器一次最多可以检测96-384个样本。这还不算上平行样本（重复实验，提高准确性），加上试剂的准备和上样等操作时间，一轮荧光PCR检测需要4-5个小时，当然结果分析和出检测报告的时间还要另算。

其次，由于新型冠状病毒属于强传染性的病毒，所以为了防止在检测过程中相关人员的感染，并不是所有的医务人员都可以参与检测工作，他们必须经过专业训练的检测员。当然，由于中央的调控，全国的医务人员对重灾区武汉的大力支持，医务人员是否足够已不是一件紧迫的事情。

最后，即使人员和仪器都到位了，也并不是所有的实验室都可以承担检测工作。像新型冠状病毒这类核酸病毒检测的实验室必须达到至少二级生物安全实验室级别，同时采用生物安全三级实验室的个人防护[3]，才能开展相应的检测。

因此，荧光PCR仪器的数量、符合条件的实验室数量、操作人员的数量成为决定新型冠状病毒核酸检测效率的重要影响因素。经过中央的紧急调控，近日湖北几个重大疫区的检测效率已大大提高。

结语

总之，新型冠状病毒的确诊并不如我们想象的那么简单，必须要走的流程让病毒检测更加严谨，更加科学。试剂盒的快速生产、迅速获批，最优的实验条件，以及国家的宏观调控，全国人民的努力为这次疫情的胜利提供了必要的条件。值得高兴的是，新型冠状病毒的检测试剂盒也正在以非常快的速度优化，确诊时间已在不断缩短，医护人员也在全力救治，疫苗的研发也紧跟其后。面对疫情，让我们共同努力，期待胜利的到来！

参考文献:

[1] 刘姗姗, 岳素文, 江洪, et al. PCR的优化与发展[J]. 临床检验杂志(电子版), 2014, 3(2):610-617.

[2] 武汉新型冠状病毒肺炎确诊，到底难在哪儿https://mp.weixin.qq.com/s/XIbJImyqWCU9O5p7c_eEzQ

[3] 生物实验室等级划分标准 http://www.sohu.com/a/255266393_346845

供稿单位：中国科学院上海巴斯德研究所

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